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    新聞資訊

    臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范

    臨床基因擴增檢驗實驗室工作規范

    為使基因擴增檢驗技術有效地應用于臨床,更好地為疾病的預防、診斷和治療服務,保證檢驗質量,特制定本規范。

    一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置及其管理

    臨床基因擴增檢驗實驗室的規范化設置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛醫發[2002]10號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》。為避免污染,必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設置標準》設置臨床基因擴增檢驗實驗室。

    臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記,以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序,即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區,避免發生交叉污染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服,以便于鑒別。此外,當工作者離開工作區時,不得將各區特定的工作服帶出。

    清潔方法不當也是污染發生的一個主要原因,因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

    ()試劑貯存和準備區

    下述操作在該區進行:貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。

    貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區,不能經過產物分析區。在打開含有反應混合液的離心管或試管前,應將其快速離心數秒。試劑原材料必須貯存在本區內,并在本區內制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用后,應將其分裝貯存備用,避免由于經常打開反應管吸液而造成污染。

    含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑,應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數來決定。

    主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩定性通過預試驗來檢查,評價結果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(在第一個高溫變性步驟后加入酶),聚合酶也可不包含在主反應混合液中。在整個本區的實驗操作過程中,操作者必須戴手套,并經常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。

    嚴禁用嘴吸取液體,加樣器和吸頭等必須經高壓處理。

     

    <PCR實驗室建設>PCR實驗室的建立

    為了對以個特定序列進行PCR做重復檢測,需要三個不同的區域,每一個區域的具體技術操作和試劑在下面詳細列出.
    1、樣品準備區
    這個區域專門用作樣品的準備,在制備和操作用于核酸提取的試劑時應該采
    取預防措施:
    1)PCR產物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。

    2)組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進樣品準備間處理,以根據應用的需要提取DNA或RNA。
    3)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。
    4)DNA樣品應該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作,以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
    5)大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。
    6)管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產生,而且管子不能用力崩開,這樣會產生氣溶膠。
    7)任何時候都應該穿實驗服和帶手套,手套要經常更換,尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間,經常清洗。
    2、樣品準備和RNA-PCR
    RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作,這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題,反轉錄一步可以在樣品準備區進行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。
    3、前PCR區
    必須有專門用于準備各種反應的區域,這個區域必須保持干凈,而且沒有來自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備,特別是專門用于前PCR區的正壓活塞式移液管。
    4、PCR實驗室試劑的操作
    1)所用的所有溶液都應該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
    2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質量的-新鮮蒸餾的去離子水,用0.22μm過濾的,并且是高壓滅菌。
    3)在20℃25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑,在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。
    4)所用試劑都應該以大體積配制,實驗一下看試劑是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。
    5)所有試劑和樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
    6)新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。
    7)樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時都應該小心保存。
    5、在前PCR區建立PCR混合物
    1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃4℃,在實驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時這樣做很有用。
    2)如果你的實驗室使用多套引物,以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經濟,可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
    3)作為一個規則,應該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且,你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。
    4)陰性樣品要與每組樣品同時做,以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產物的污染,陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。
    5)當做陽性對照時,有兩個理由決定了應該使用最少數量的核酸。

    6)由于必須有對照反應,對照模板的特點應該予以考慮。
    6、控制污染的方法
    已設計出很有力的酶學方法用來消除一種形式的污染—使用UNG,這一技術能有效地消除由PCR產物引起的污染。

    <PCR實驗室建設>標準的PCR實驗室建設方案

    1、主體結構:
    主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁,從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固,線條簡明,美觀大方,密封性好。
    2、標準的三區分隔和氣壓調節:
    將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增檢測三個獨立的實驗區。整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區, 同時各區通過氣壓調節,使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。
    可打開緩沖區Ⅰ,緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風扇往外排氣,在實驗區的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口,空氣通過回風口向室內換氣。
    3、消毒:
    在三個實驗區和三個緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈,供消毒用。
    在試劑準備區和標本制備區 還設置移動紫外線燈,對實驗桌進行局部消毒。
    4、機械連鎖不銹鋼傳遞窗:
    試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼(不建議使用電子連鎖方式)傳遞窗傳遞,保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染(人物分流)。
    5、地面
    地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面,整體性好。便于進行清掃,耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面,或大塊的瓷磚(至少800mm×800mm)接縫需要小于2mm
    6、照明
    燈具要選用凈化燈具,能達到便于清洗、不積塵的特點。

    在建設的過程中應注意:
    ●規范的安裝流程和全面的服務流程。
    ●嚴格按照規范科學設計的安裝流程。
    ●安裝前需要確定以下安裝條件,如:電源電壓,電源進線位置,電話網絡線進線位置,進水水壓,最小安裝空間,地面平整度,通風孔、進水管和下水管的位置等,理想狀態的空間尺寸和通風口尺寸。

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